PREGUNTA Nº 1 a) Indique las reacciones involucradas en la transdesaminación de alanina. ¿Cómo será la velocidad de la transdesaminación de alanina en el estado de saciedad? Justifique. b) En qué reacción participa el esqueleto carbonado que se puede obtener a partir de la transdesaminación de la alanina? Señale la reacción involucrada, sustratos, cofactores y productos de esta reacción c) ¿Cómo se regula la actividad de la enzima mencionada en el ítem (b) en estado de ayuno? Justifique. d) Señale los principales destinos metabólicos de los productos que se obtienen a partir de la reacción mencionada en el ítem (b). RESPUESTAS a) alanina + alfa-cetoglutaratoÛglutamato + piruvato(transaminasa), y luego glutamato + NADP+ (o NAD+)ÛNH3 + alfa-cetoglutarato + NADPH (o NADH) + H+ (glutamato deshidrogenasa, GDH). En saciedad: los niveles de ATP (o GTP) aumentados inhiben alostéricamente a la GDH, por lo tanto la transdesaminación estará inhibida. b) Reacción catalizada por la Piruvato Deshidrogenasa: piruvato + CoA + NAD+®Acetil-CoA + NADH + H++ CO2. Cofactores: pirofosfato de tiamina, ácido lipoico, NAD+, FAD, Coenzima A. Alternativamente: Reacción catalizada por la piruvato carboxilasa: piruvato + HCO3-+ ATP®oxaloacetato + ADP + Pi (biotina) c) En ayuno: La actividad de la piruvato deshidrogenasa estará inhibida porque la enzima se fosforila por la quinasa (PDK) que se activa por AcCoA, ATP y NADH, además el AcCoAy el NADH inhiben alostéricamente a la PDH. La enzima piruvato carboxilasa se activa por el modulador alostérico Ac CoA, cuyos niveles se incrementan en el ayuno. d) El producto de la actividad de la piruvato deshidrogenasa, el Acetil CoA puede: oxidarse completamente en el Ciclo de Krebs, combinarse con oxaloacetato para formar citrato que se utiliza para la síntesis de AG, puede formar cuerpos cetónicos. El NADH se reoxidará en la cadena de transporte de electrones y el CO2 se eliminara por la respiración El producto de la piruvato carboxilasa, el oxaloacetato se utiliza para la gluconeogénesis. PREGUNTA Nº2 a) Indique todas las enzimas involucradas en la reducción de la ubiquinona b) Explique el efecto de la oligomicina sobre el consumo de oxígeno c) Explique por qué se pueden formar radicales libres en la cadena de transporte de electrones. ¿Qué compuestos no enzimáticos pueden regular la concentración de estas especies en la mitocondria? d) Dados los potenciales de reducción estándar de las siguientes hemirreacciones: R=1,98 cal/mol. K F= 23062 cal/mol.V Piruvato + 2 H+ + 2 e- → lactato E°´ = -0,185 V NAD+ + 2 H+ + 2 e- → NADH + H+ E°´ = -0,320 V Para el caso en el cual la temperatura es 37° C y las concentraciones intracelulares son [piruvato] = 0,05 M [NAD+] = 0,15 M [lactato] = 0,05M Escriba la reacción de reducción del piruvato y calcule la concentración intracelular de [NADH] cuando la reacción se encuentra en el equilibrio.
2. RESPUESTAS a) Complejo I (NADH deshidrogenasa), Complejo II (Succinato Deshidrogenasa), Glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, Acil-CoA deshidrogenasa. b) La oligomicina bloquea la entrada de protones a la matriz mitocondrial mediante la ATP sintetasa, y por lo tanto inhibe la síntesis de ATP. Como consecuencia, aumenta el gradiente de H+ hasta que la cadena no puede seguir transfiriendo más protones hacia el espacio intermembrana y por lo tanto se frena el consumo de oxígeno. c) Los radicales libres se pueden formar en aquellas reacciones donde se transfieren electrones en forma individual. El principal radical libre que se puede formar en la cadena de transporte de electrones es el anión superóxido, en el proceso de reducción del oxígeno molecular. Durante la reducción de la molécula de oxígeno a agua se produce ganancia de electrones en cuatro etapas, la primera de ellas genera el radical superóxido mientras que las transferencias de los dos siguientes electrones producen la especie reactiva peróxido de hidrogeno y el radical hidroxilo. Los compuestos no enzimáticos capaces de regular la concentración de estas especies son la vitamina E y el glutatión. d) Respuesta: Piruvato + NADH + H+ ® Lactato + NAD+ ΔG = 0 ΔE = 0 E = E°’ + RTln [oxidado] n F [reducido] -0,185 V = -0,320 V + 1,98 cal/mol. K. 310K .ln y 2. 23062 cal/mol.V -0,185 V = -0,320 V + 0,013 .ln y -0,185 V + 0,320 V = ln y
0,013 10,38 = ln y y= 32208=0,15M y entonces X= 4,6 10-6M X También se aceptó el cálculo de la concentración de NADH utilizando la ecuación de DG. Se tuvo en cuenta el procedimiento seguido ya que los valores pueden cambiar según la aproximación utilizada. PREGUNTA Nº3 Con respecto al trabajo práctico de determinación de los parámetros cinéticos de la ureasa, responda: a) ¿Qué información se obtiene cuando Ud. incubó una determinada concentración de sustrato en presencia de la enzima durante diferentes intervalos de tiempo? b) Represente en un mismo gráfico los resultados que Ud. debería haber obtenido a partir de las mediciones de absorbancia a distintos tiempos de incubación, comparando la concentración más baja de sustrato con respecto a la más alta. c) ¿Cómo transformó los valores de absorbancia en los de concentración de amoníaco? d) Si la temperatura del baño de incubación hubiera sido menor que la deseada (20ºC en lugar de 37ºC), ¿qué resultado diferente de los que calculó, hubiera obtenido en esta condición? Justifique. RESPUESTAS a) Se realizan incubaciones por distintos tiempos para cada concentración de sustrato con el fin de determinar la velocidad inicial de la reacción (para cada concentración de sustrato), que se obtiene a partir de la tangente al origen de la curva de [Producto] en función del tiempo. b) Gráfico: Diferencias entre menor y mayor concentración: i) en el punto final: es mayor la cantidad de producto formado a partir de más sustrato y ii) en la pendiente inicial: es mayor cuanto más sustrato inicial haya. c) En el TP lo hicieron con el coeficiente de extinción molar e (aplicando la ley de Beer donde A= e b c, donde c=concentración y b, una constante) pero también podrían decir que se usa una curva de calibración. d) El parámetro cinético que varía con la temperatura es la Vmax